EXPRESIÓN DE GENES DE CHOQUE TÉRMICO EN BOVINOS DE DOBLE PROPÓSITO EXPUESTOS A ESTRÉS CALÓRICO
El cambio climático impacta nuestros ecosistemas llevando a los seres vivos a sobrevivir en condiciones cada vez más extremas. El incremento de la temperatura ambiental continúa su curso a pesar de las diferentes medidas que se han tomado para mitigar este problema, el cual afecta al sector ganadero, disminuyendo los índices productivos y reproductivos. La respuesta animal a este evento es intentar una aclimatación exitosa para evitar los estragos que el estrés calórico provoca en el organismo.
Angelica Torres Heredia
La aclimatación es la respuesta fenotípica desarrollada por los animales a una fuente específica de estrés ambiental (Nardone et al., 2010). La termo-tolerancia adquirida es transitoria en la naturaleza y depende principalmente de la severidad inicial del estrés calórico, a mayor dosis inicial de calor, mayor magnitud y duración de la termo-tolerancia (Kregel, 2002).
La identificación de adaptabilidad en las diferentes razas bovinas tiene como finalidad encontrar cual se adapta mejor a un ecosistema específico, así como se ha estado buscado frecuentemente en las zonas tropicales y subtropicales, en donde es muy común la introducción de razas occidentales de animales domésticos y éstas sufran un balance negativo de energía, así como un aumento de temperatura y frecuencia respiratoria causado por estrés calórico (Bañuelos, 2005).
Se han estado utilizando las proteínas de choque térmico (hsp, por sus siglas en inglés) como un indicador de adaptabilidad de los bovinos al estrés calórico, ya que estas proteínas son mediadoras de la respuesta al choque térmico (Hyder et al., 2017).
Una de las primeras funciones fisiológicas asociadas con la acumulación inducida por el estrés de la hsp70 es la termo-tolerancia adquirida. Diversos estudios han demostrado que la inducción de la hsp70 en roedores está asociada con el desarrollo de la tolerancia a una variedad de tipos de estrés, incluyendo hipoxia, isquemia, acidosis, desgaste energético, citoquinas, como el factor de necrosis tumoral, y radiación ultravioleta (Barbe et al., 1988; Marber et al., 1995; Sciandra & Subjeck, 1983).
La estimación de la magnitud de la expresión de genes hsp en bovinos puede ayudar a desarrollar futuros programas de cruzamiento al identificar animales que puedan mantener una mayor integridad celular y homeostasis bajo estrés calórico. Con base en lo anterior, se realizó un estudio en el que se planteó que podrían existir diferencias en la expresión de los genes hsp en relación con la hora de la toma de muestra, el grupo racial, el porcentaje de genes Bos taurus y el estado fisiológico de vacas de doble propósito en clima tropical.
Se tomaron muestras de sangre de 33 hembras bovinas cruzadas Holstein x Cebú y Suizo Pardo x Cebú, en lactación y horras, pertenecientes a un hato de doble propósito del campo experimental La Posta del INIFAP. Se obtuvieron la temperatura ambiental (T) y la humedad relativa (HR) a través de una estación climatológica y con estos valores se determinó el índice de temperatura-humedad relativa (ITH) para tenerlo como referencia, ya que con un índice de 72 e incluso a veces menor los bovinos comienzan a presentar estrés calórico. El estudio se llevó a cabo en el mes de agosto, cuando la temperatura es más alta. Las muestras se colectaron en dos diferentes periodos del día, en la mañana, de 07:00 a 09:00 horas, y en la tarde, de 13:00 a 15:00 horas.
Se colectaron 5 ml de sangre de la vena coxígea en tubos con EDTA y se mantuvieron en cadena fría hasta su arribo al laboratorio. El mRNA se obtuvo mediante el método comercial SV Total RNA Isolation System de la marca Promega. Posteriormente, la concentración y pureza del mRNA se verifico por espectrofotometría en un equipo NanoDropTM 2000 de la marca Thermo Fisher ScientificTM. La síntesis del cDNA se realizó por retro-transcripción del mRNA con el método comercial GoScriptTM Reverse Transcription System de la marca Promega.
El análisis de la expresión se llevó a cabo en los genes hsp60, hsp70 y hsp90, para lo que se utilizó el gen endógeno β-actina como gen constitutivo de referencia. Los genes se amplificaron por qPCR dúplex en un equipo StepOnePlusTM Real-Time System con iniciadores y sondas marcadas con fluorescencia. Las sondas de los genes hsp se marcaron con el fluoróforo FAM y el gen β-actina con el fluoróforo HEX. El silenciador empleado en todas las sondas fue TAMRA.
La mezcla de reacción se realizó en un volumen final de 15 μL, con 1X de TaqMan® Fast Advanced Master Mix de la marca Thermo Fisher ScientificTM, 400 nM de los iniciadores sentido y antisentido, 200 nM de sonda marcada y 200 ng de DNA.
Para el gen hsp60, las condiciones de amplificación fueron un ciclo de desnaturalización inicial a 95°C durante 10 minutos y 45 ciclos de desnaturalización a 95°C durante 15 segundos y alineamiento/extensión a 65°C durante 60 segundos, mientras que para los genes hsp70 y hsp90 fueron un ciclo de desnaturalización inicial a 95°C durante 10 minutos y 45 ciclos de desnaturalización a 95°C durante 15 segundos, alineamiento a 65 y 62°C, respectivamente y extensión a 72°C durante 40 segundos.
La expresión de los genes hsp se determinó con el método comparativo ΔΔCt (método de cuantificación relativa), usando el gen β-actina de referencia, comparado contra un animal de referencia. El método de cuantificación permite conocer la concentración presente en una muestra, es decir, el número de copias que se van a expresar de ese gen en la muestra. Entre menor sea el número de ciclos del gen existe mayor expresión, por lo tanto, el ΔΔCt será menor cuando exista un incremento de dichos ciclos.
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